piątek, 2 stycznia 2009

Aminokwasy - produkcja syntetyczna




AMINOKWASY

Aminokwasy są powszechnie stosowane, jako dodatki do żywności, zwłaszcza w celu podniesienia jej wartości odżywczej; są także używane w przemysłach farmaceutycznym, kosmetycznym i In. W zależności od rodzaju, aminokwasy mają smak kwaśny, słony, gorzki, słodki; mogą też intensyfikować smak żywności. Należy zaznaczyć, że 95% globalnej produkcji aminokwasów to: L-lizyna, L-metionina, a zwłaszcza kwas L-glutaminowy, gdyż są powszechnie wykorzystywane, jako dodatki do żywności i pasz.
Najstarszą, najbardziej pracochłonną i kosztowną metodą otrzymywania aminokwasów była metoda ich ekstrakcji z hydrolizatów odpadów przemysłu mięsnego, kazeiny i glutenu. Niepełna hydroliza wiązań peptydowych, rozkład niektórych aminokwasów, drogie oczyszczanie oraz ograniczenie źródeł i zmienność składu surowców skłoniły do poszukiwania nowych metod otrzymywania aminokwasów.
Ze względu na duże zapotrzebowanie rynku na aminokwasy, podjęto badania nad możliwością chemicznej syntezy tych substancji. Synteza chemiczna wymaga zastosowania wysokiej temperatury, wysokiego ciśnienia, toksycznych związków chemicznych i kosztownej aparatury, co powoduje, że tylko produkcja dużych ilości danego aminokwasu może być opłacalna. Ponadto w wyniku syntezy chemicznej otrzymuje się racemiczną mieszaninę D- i L-aminokwasów, co wymaga dodatkowego procesu do ich rozdzielenia, jako że forma D-aminokwasu może być szkodliwa dla zdrowia. Jednakże kilka aminokwasów produkuje się tą metodą, np. z akroleiny otrzymuje się D,L-metioninę, z cykloheksanu D,L-lizynę, a z indolu i kwasu nitrooctowego – D,L-tryptofan.
W latach pięćdziesiątych opracowano liczne technologie produkcji aminokwasów metodą syntezy enzymatycznej i biosyntezy mikrobiologicznej. Obecnie wiele aminokwasów produkuje się metodą syntezy enzymatycznej, a metodą biosyntezy mikrobiologicznej produkuje się głównie L-lizynę, kwas L-glutaminowy, kwas L-asparginowy – używane, jako dodatki do żywności. Dzięki syntezie enzymatycznej można produkować L-aminokwasy, jednak wymaga ona kosztownych prekursorów i często drogich, czasami nawet kilku enzymów. Metodą syntezy enzymatycznej uzyskujemy większy wydatek aminokwasowi z prekursorów i większe stężenie aminokwasu w roztworze niż tańszą metodą biosyntezy mikrobiologicznej.
Dobierając odpowiednie enzymy, można produkować L-aminokwasy z mieszaniny racemicznej D,L-prekursora. Przykładowo z D,L-alfa-amino- e-kaprolaktamu, otrzymane go metodą syntezy chemicznej, przy użyciu enzymu L-hydrolazy z Drożdż Cryptococcus, Candida lub Trichosporon można otrzymać L-lizynę. Racemaza z bakterii Achromobacter, Flavobacterium przekształca pozostałą formę D-kaprolaktamu w formę L-, z której ponownie przy użyciu L-hydrolazy otrzymujemy L-lizynę.
Używając kwasu fumarowego i amoniaku oraz aspartazy otrzymanej z Escherichia coli uzyskuje się kwas L-asparaginowy w stężeniu 560g / dm3.
Również z mieszaniny N-acetylo-D,L-aminokwasów, używając aminoacylazy z A. Oryzae, otrzymuje się L-aminokwasy, a pozostałą formę D-prekursora poddaje się racemizacji.
Ponieważ w procesie syntezy enzymatycznej używa się prekursorów i enzymów o dużej częstości, zastosowanie immobilizowanych enzymów umożliwia znaczne obniżenie kosztów enzymów, automatyzację procesu, pełniejsze wykorzystanie prekursorów, co w konsekwencji może obniżyć koszt produkcji danego aminokwasu o kilkadziesiąt procent. Jednakże biosynteza mikrobiologiczna jest znacznie tańsza ze względu na fakt, że składniki pożywki są zazwyczaj tanie, proces przebiega w niższej temperaturze i uzyskuje się wyłącznie L-aminokwasy.
Wiadomo, że drobnoustroje syntetyzują wiele aminokwasów niezbędnych do budowy specyficznych białek. Geny odpowiedzialne za biosyntezę poszczególnych aminokwasów „kontrolują” aktywność enzymów biorących udział w biosyntezie danego aminokwasu, aby nie dopuścić do jego nadprodukcji.
W wyniku selekcji drobnoustrojów można uzyskać organizmy przydatne do przemysłowej produkcji aminokwasów. Jednocześnie przez dobór warunków hodowli a zwłaszcza mutagenizację drobnoustrojów metodami fizycznymi, chemicznymi lub inżynierii genetycznej, można uzyskać organizmy zdolne do nadprodukcji danego aminokwasu.
Mutagenizacja umożliwia uzyskanie tzw. auksotroficznych mutantów, tj. drobnoustrojów z rozkojarzonym systemem regulacji, powodujących nadprodukcję danego aminokwasu ze związku chemicznego, który jest prekursorem dla zahamowanej biosyntezy innych aminokwasów. Aminokwas, którego biosynteza została zahamowana, powinien być dodawany do pożywki. Mutagenizacja wywołuje zmiany kierunków metabolicznych w wyniku zmiany aktywności określonych enzymów, co powoduje zahamowanie biosyntezy niektórych aminokwasów, a nadprodukcję pożądanego. Mutacja genu regulatorowego może spowodować stałe ograniczenie syntezy określonych enzymów uczestniczących w syntezie danego aminokwasu, a mutacja genu strukturalnego powoduje, że drobnoustrój staje się niewrażliwy na nadmiar danego aminokwasu i nie ogranicza jego syntezy.
Nadprodukcję aminokwasu można uzyskać przez dodanie do pożywki określonego prekursora, np. dodanie do pożywki L-homoseryny zwiększa biosyntezę L-treoniny przez Bacillus subitilis lub Proteusz rettgeri (wirusy i drobnoustroje).
Niejednokrotnie w czasie hodowli drobnoustrojów do pożywki dodaje sięzwiązki powodujące zwiększenie przepuszczalności błony cytoplazmatycznej, a tym samym nadprodukcję pożądanego aminokwasu.
L-lizyna determinuje wartość biologiczną białka, a zwłaszcza zwiększa wykorzystanie białek roślinnych zwartych w paszy. Roczna produkcja w świecie L-lizyny wynosi około 80 tysięcy ton. Do produkcji L-lizyny w skali przemysłowej używa się bakterii z rodzaju Corynebacterium i Brevibacterium. Również drożdże są zdolne do syntezy L-lizyny, jednak nie używa się ich w przemysłowej produkcji tego aminokwasu.
Przebieg biosyntezy L-lizyny przez drobnoustroje przedstawia się następująco. Szczawiooctan z cyklu kwasów trikarboksylowych może się aminotransferazę glutaminianowi ulec przemianie w L-asparaginian, z którego kinaza asparaginowa katalizuje powstanie, semialdehydu beta-asparaginowego.
Dehydrogenaza homoserynowa z semialdehydu beta-asparaginowego jest pierwszym enzymem szlaku warunkującym powstanie L-homoseryny, a następnie L-metioniny, L-treoniny lub Izoleucyny. Enzymem decydującym o syntezie L-lizyny z semialdehydu jest syntetaza dihydrodipikolinianowa. Aktywność kinazy asparaginowej można w 90% zahamować nadmiarem L-lizyny i Treoniny, natomiast L-izoleucyna i L-walina zwiększają jej aktywność o 50%, znosząc jednocześnie hamujące działanie L-lizyny i L-treoniny.
Aktywność dehydrogenazy homoserynowej jest kilkunastokrotnie większa od aktywności syntetazy dihydrodipikolianowej, co preferuje syntezę L-metionyny, L-treoiny i L-izoleucyny. Dlatego w biosyntezie mikrobiologicznej L-lizyny używa się mutantów auksotrficznych, które nie syntetyzują dehydrogenazy homoserynowej lub mutantów regulatorowych, których kinaza asparaginowa jest niewrażliwa na obojętność analogu L-lizyny, tj. S-(2-aminoetylu)-L-cysteiny i L-treoniny. Najkorzystniej jest używać drobnoustrojów wykazujących te dwa rodzaje mutacji.
Źródłemwęgla w hodowli bakterii może być: melasa z buraka cukrowego, melasa z trzciny cukrowej, glukoza, alkohol etylowy, kwas octowy, n-parafiny, a źródłem azotu: sole amonowe, hydrolizat białek sojowych.
Do pożywki dodaje się L-homoserynę lub L-treoninę i L-metioninę. Aby ograniczyć syntezę kwasu L-glutaminowego, do pożywki dodaje się ponad 30mikrogramów / dm3 biotyny. Jeżeli składnikiem pożywki jest melasa z trzciny cukrowej, to biotyny się nie dodaje. Kwasowość pożywki (pH 6,9-7) utrzymuje się używając amoniaku. Czas napowietrzanej hodowli w temperaturze 28 – 33 stopni Celsjusza wynosi do 48 h. Wydajność syntezy L-lizyny w zależności od użytego drobnoustroju i źródła węgla w pożywce przedstawiono w tabeli 6.1





Po zakończeniu hodowli płyn pohodowlany, zawierający oprócz L-lizyny wiele innych cennych składników, zagęszcza się do 40% s.s., otrzymując preparat paszowy L-lizyny.
W celu otrzymania koncentratu L-lizyny oczyszczony płyn pohodowlany zakwasza się kwasem solnym, otrzymując chlorowodorek L-lizyny, który adsorbuje się na kationowej kolumnie jonowymiennej. L-lizynę wymywa się amoniakiem i ponownie zakwasza kwasem solnym. Po zagęszczeniu roztwór suszy się, uzyskując 70-proc. koncentrat L-lizyny lub poddaje krystalizacji i po rozpuszczeniu oraz ponownej krystalizacji otrzymuje się 97 – 98-proc. koncentrat.
Kwas L-glutaminowy, ze względu na duże znaczenie, jako intensyfikatora smaku żywności zwłaszcza w postaci glutaminianu sodu, produkuje się w ilości ponad 400 tysięcy ton rocznie. Kwas L-glutaminowy był pierwszym aminokwasem produkowanym w skali przemysłowej z hydrolizatu białek sojowych lub hydrolizatu glutenu.
Zdolność biosyntezy kwasu L-glutaminowego wykazują bakterie rodzaju Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium i Arthrobacter. Wyselekcjonowane bakterie Corynebacterium glutamicum w 1957 roku zostały użyte w Japonii do przemysłowej produkcji kwasu L-glutaminowego
Przebieg biosyntezy kwasu L-glutaminowego przez drobnoustroje przedstawia się następująco. Powstający w cyklu kwasów trikarboksylowych 2-oksoglutaran ulega przemianie do kwasu L-glutaminowego w obecności dehydrogenazy glutaminianowej lub też może ulec dalszej przemianie w cyklu Krebsa zapoczątkowanej przez dehydrogenazę 2-oksyglutaranową. W auksotrficznych mutantach bakterii C. glutamicum lub B Flavum aktywność dehydrogenazy oksyglutaranowej jest bardzo mała, natomiast dehydrogenazy glutaminianowej bardzo duża, co zapewnia nadprodukcję kwasu L-glutaminowego. Źródłem węgla w pożywce do hodowli bakterii może być glukoza, sacharoza, hydrolizowana skrobia, melasa, alkohol etylowy, kwas octowy, n-alkany. Jako źródło azotu stosuje się sole amonowe, amoniak, mocznik.
Bakterie syntetyzujące kwas glutaminowy, hodowane na pożywce zawierającej dużo biotyny, nie są zdolne do nadprodukcji kwasu L-glutaminowego. Optymalne stężenie biotyny sprzyjające nadprodukcji aminokwasu na pożywce zawierającej 10% glukozy wynosi 5 mikrogramów / dm3.
W celu zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej w czasie hodowli bakterii stosuje się dodatek detergentów, penicyliny, cefalosporyny, nasyconych kwasów tłuszczowych C16-C18. Przykładowo, proces biosyntezy kwasu L-glutamionwego przy użyciu Brevibacterium divaricatum NRRL B-231 przestawia się następująco:
- inokulum 6% stanowi 16-godzinna hodowla bakterii w temp. 35 stopni Celsjusza na pożywce o składzie g / dm3: glukoza – 40; KH2PO4 – 1; MgSO4 x 7H2O – 0,5; ekstrakt drożdżowy 1; mocznik 8;
- pożywka hodowlana zawiera g / dm3: 121 glukozy; 5 – octanu amonu; 6 – scukrzonej skrobi; 1,2 – KH2PO4; 1,2 – K2SO4; 6 – MgSO4; FeSO4 x 7H2O i MnSO4 x H2O po 6 ppm oraz odpieniacz Hodag K-67

Na początku hodowli dodaje się kwasu oleinowego w ilości 0,65 cm3 na 1 dm3 pożywki. Początkowe pH 8,5 pożywki obniża się i jest utrzymywane na poziomie 7,8. Hodowlę prowadzi się przez 14h w temperaturze 32 – 33 stopnie Celsjusza, którą następnie podwyższa się do 38 stopni. Podczas hodowli zawartość glukozy w pożywce obniża się do 0,5 – 2% i wówczas dodaje się 160 gram glukozy na dm3 pożywki. Podczas hodowli kontroluje się napowietrzanie; zawartość CO2 w pożywce nie powinna przekraczać 4,5%.
Po 30 – 35 h hodowli otrzymuje się w pożywce około 100 gram / dm3 kwasu L-glutaminowego. Wydajność biosyntezy kwasu L-glutaminowego w zależności od użytego drobnoustroju i źródła węgla w pożywce podano w tab. 6.2


Po zakończeniu hodowli z pożywki usuwa się komórki bakterii i dodaje mleka wapiennego. Roztwór L-glutaminianu wapnia doprowadza się do pH 3,2, tj. punktu izoelektrycznego kwasu glutaminowego. Kwas L-glutaminowy krystalizuje po schłodzeniu roztworu.
Aby otrzymać glutaminian sodu, kryształy L-glutaminianu rozpuszcza się w wodzie i dodaje wodorotlenku sodu do uzyskania kwasowości roztworu pH 6,8. Otrzymany roztwór glutaminianu sodu zagęszcza się i ponownie przeprowadza jego krystalizację. Kryształy odwirowuje się i suszy.

Brak komentarzy: